Roger J. Laham, Michael Simons, Frandk Sellke
Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, Massachusetts
Annular Review of Medicine 2001 52:15-27

כ 37-20 אחוז מהחולים במחלת לב איסכמית לא יכולים לעבור PTCA או CABG. לרבים מהחולים יש עדיין סימפטומים של איסכמיה למרות טיפול תרופתי מקסימלי. טיפול עתידי אפשרי הוא אנגיוגנזיס. העברת גנים בקרדיולוגיה תוכל תיאורטית לסייע גם לחולי היפרליפידמיה משפחתית, חוסר ליפופרוטאין a, קרדיומיופטיה היפרטרופית, דיסטרופיה, ואולי מומי לב מולדים.

וקטורים לטיפולים בגנים
כאשר דנ"א "ערום" בא במגע עם ממברנת תא, רק חלק קטן נכנס לתוך התא. התוצאה היא יעילות נמוכה של העברה. לכן יש צורך בנשא או וירוס להעלות את "יעילות הטרנספקציה"
(Transfection העברת דנ"א עירום לתוך תאים אאוקריוטים, בניגוד ל-transduction שפירושו הכנסת דנ"א בעזרת בקטריופאג).

נשאים לא וירליים
פלסמיד עירום או דנ"א ליפוזומלי הם הנשאים הנפוצים ביותר. הבעיה היא שרק חלק קטן מהדנ"א נכנס לגרעין, שם הוא נשאר במיקום אפיזומלי (לא עובר חיבור לגנום של התא). התוצאה היא ביטוי טרנסגני בטווח זמן מוגבל. תיאורטית עד 4-3 שבועות, אך לרוב משך הזמן קצר יותר. היצור והאחזקה של פלסמיד והקומפלקס הליפוזומלי הם יחסית קלים, אך היעילות הפחותה של טרנספקציה, כמו גם משך הביטוי הקצר, מגבילים את השימוש בשיטה זו. וקטורים לא וירליים ככל הנראה אינם מספיקים להגיע לריכוזים תרפואיטים של יצור חלבונים בוף, אך הם יעילים מאוד בגרימה של תגובה חיסונית רצויה ("חיסון דנ"א").

פורמולות של פוספוליפידים מסוגלות לשפר את יעלות הטרנספקציה. וכן פלסמידים מבוססי EBV יכולים להאריך את משך ביטוי הגן לרמות תרפואיטיות ובנוסף קיימת האפשרות להדבקה חוזרת כל תקופת זמן.

וקטורים וירליים
אדנו וירוסים נכנסים לתאים דרך רצפטורים ספציפיים ובהמשך עוברים פירוק בתוך ליזוזומים (דגרדציה). הדנ"א הוירלי משתחרר לציטולסמה וחלקו חודר לגרעין, שם הוא נשאר במיקום חוץ כרומוזומלי. ניתן לייצר אדנו וירוסים חסרי יכולת התרבות (replication deficient) בתוך תאי "אריזה" ע"י הוצאה של מספר חלקים בגנום (E1, E3) בכדי למנוע את יכולתם להתרבות. לשימוש באדנו וירוס יתרון של יצור פשוט בריכוזים גבוהים, הם בעלי יעילות טרנסדוקציה גבוהה והם בעלי יכולת להדביק תאים אף אם אינם בשלבי פרוליפרציה. הבעיה הנוכחית בשימוש בהם היא התגובה הדלקתית המקומית בזמן החדרתם לגוף, אשר מונעת בסופו של דבר את הביטוי הגנטי. נוגדנים לוירוס הנמצאים במחזור הדם, אשר הם שכיחים בחלק מטיפוסי האדנווירוסים, מורידים משמעותית את משך ועוצמת הביטוי. שימוש בשיטות חדשות (encapsidated gutted) יוכל להפחית את התגובה הדלקתית. שיטות אלו מאפשרות גם להעלות את יכולת הנשאות של הוירוסים ומאפשרות להם לשאת חלקי דנ"א ארוכים יותר, כמו למשל הגן למולקולה dystrophin.

וירוסים רקומביננטיים דמויי אדנו (AAVs Adeno Associated Viruses) הם התפחות מבטיחה בתחום נשאות גני כיוון שהם חודרים לתאים לא מתחלקים ומאפשרים ביטוי גני ממושך בטווח רקמות רחב. הבעיה היא הקושי ביצור והם בעלי "מחסנית ביטוי" קטנה עדיין. שיטות חדשות יותר ליצור המוני יותר, סקירה ואפיון וקטורים מסוג AAV ומגבלת הגודל תפתר ע"י שימוש בגישה של וקטור כפול.

רטרו וירוסים חודרים לתא דרך רצפטורים ספציפיים ואז ה RNA הוירלי עובר תרגום הפוך לדנ"א, אר עובר חיבור לכרומוזום התאי. חיבור זה נותן ביטוי יציב וממושך של הגן הרצוי. רטרו וירוסים חסרי יכולת התרבות מיוצרים במעבדה בתוך קוי תאי אכסון
(package) מיוחדים המכילים גנים לרטרו וירוסים (G,P,E) אשר נמחקו מהגנום הרטרו וירלי. רטרו וירוסים יכולים להדביק רק תאים מתחלקים, דבר המגביל את אוכלסיית תאי היעד האפשריים.
הם גם מוגבלים ע"י ריכוזם הנמוך. בעיה נוספת היא שלעיתים ההחדרה של הגנים מסתבכת בחוסר שיפעול של ה Long Terminal Repeats LTRsאו ביצור של מרכיבי רפליקציה של הרטרווירוסים.
בעיות אלו ונוספות נפתרו ע"י שימוש בוקטורים מודולריים, כאשר משלבים את התכונות הרצויות של וקטורים שונים. דוגמאות כוללות את השימוש הסינרגיסטי ב"וירוזום" ליפוזום ווירוס, או מרכיבים אדנו-רטרו וירוסים, או כימרים משיגים MLV/LV30. בנוסף פותחו שימושים בלנטי-וירוסים ועוד, אשר עדיין בשלבי פיתוח בתחום זה.

העברת גנים מבוססת תאים
זוהי שיטה חדשה ומבטיחה העושה שימוש בתאים אוטולוגיים אשר עברו טרנספקציה עם טרנס-גן אשר אנו מעוניינים בו. שיטה זו עוקפת את בעיית התגובה הדלקתית. שיטה זו משיגה ביטוי ממושך ע"י טרנפקציה יציבה של הגן הרצוי במדידות חוזרות. בנוסף, ניתן ליצור מבנה רב-גני אשר מאפשר ביטוי ממושך, נשלט ויציב.
לבדיקת שיטה זו, נבדק השימוש בתאי אנדותל כפוטנציאל להעברת הגן לאפופרוטאין E בעכברים שעברו knockout של גן זה. לאחר השתלת תאי אנדותל המפרישים apoE לעכברים, נמצאה רמות כולסטרול נמוכות יותר מאשר בעכברי ביקורת. בנוסף, נמצאה ירידה משמעותית בגודלם של רבדים טרשתיים באאורטות של אותם עכברים.
במחקרים נוספים הודבקו קוי תאים בוקטור רטרו וירלי המכיל דנ"א של אריטרופוייטין ביחד עם promotor הרגיש להיפוקסיה. במעבדה הראו תאים אלו עליה פי 3 בהפרשת הדנ"א הזה בתגובה להורדת אחוזי החמצן מ 21% ל-1.3%. כאשר חושפים בעלי חיים לריכוזי חמצן נמוכים (7%) ניתן להדגים עד פי 2 הפרשה של דנ"א של אריטרופוייטין (hEpo), לעומת בעלי חיים החשופים לריכוזי חמצן רגילים (21%).

צרכים מיוחדים של המערכת הקרדיווסקולרית:
בחולים הלוקים בהפרעות בפגם גנטי פרטני הקשורות למערכת הלב וכלי הדם, כמו היפרכולסטרולמיה משפחתית, דיסטרופיות שונות או חוסר Lpa, יש צורך למצוא דרך לביטוי קבוע ממושך של הגן הטפולי. מצד שני, במצבים קרדיווסקולרים של טווחי זמן קצרים, כמו היצרות מחודשת של עורק לאחר הרחבה ע"י בלון או בתומכון תוך כלילי, עדיפות האפשרויות של ביטויי גנים לתקופה מוגבלת. אנגיוגנזיס למשל, עדיף שיבוצע תוך שימוש בוקטור בעל ביטוי חולף, כיוון שביטוי ממושך של ציטוקינים אנגיוגניים עלול לגרום לאנגיוגנזיס פתולוגי.

החדרת וקטורים נושאים גנים:
למרות החיפושים הממושכים למציאת וקטור נושא הגן המושלם, והמחשבות השונות למציאת מולקולת המטרה אשר תבנה ע"י אותו גן, הרי השאלה של העברה אופטימלית טרם התבררה. כלי הדם ושריר הלב מהווים מטרות קלות להשגה עקב הנגישות הגבוהה והצורך בתקופת ביטוי לטווח זמן מוגבל. בעבר חשבו שניתן להסתפק בהגעתו של הנשא אל המטרה ויצירת מגע בינהם ואילו תגובת ההמשך נלקחה כמובן מאליו. כלי הדם ושריר הלב חשופים לזרימת דם מהירה המובילה להסחפות והעלמות אותם וקטורים לאחר מגע קצר בלבד עם תאי המטרה. החדרת הנשאים לתוך העורקים הכליליים גורמת למעשה להעברתם לכלי הדם הסיסטמיים וחושפת איברים נוספים לוקטור.

החדרה ישירה לשריר הלב, בדרך אפיקרדיאלית בגישה ניתוחית, או לאנדוקרד בעזרת צינטור, נותנת יעילות טרנספקציה זהה ובכך ניתון לחסוך את צורך בניתוח. אחת הבעיות הכרוכות בהחדרת הנשאים היא בכך שלעיתים הציוד בשימוש להעברתם עלולה לגרום לאינאקטיבציה של חלקיקי הוירוס או הפלסמיד ובעיה זו טרם נחקרה דיה.
למשל העברת נשאים בעזרת קטטר גורמת לאינאקטיבציה משמעותית של חלקיקי אנדווירוס, אשר הינה פרופורציונלית לזמן שהייתם בקטטר (הזמן בין מילוי הקטטר לבין ההזרקה). העברת פלסמידים מורידה משמעותית את יעליות הטרנספקציה באופן פרופורציונלי למהירות ולחץ ההזרקה. יש להדגיש שכל הניסויים הללו נעשו תקופה משמעותית לאחר שכבר בוצעו מחקרים קליניים עם אותם וקטורים.

אנגיוגנזיס טיפולי:
אנגיוגנזיס הינו תהליך מורכב אשר מערב גרוי לתאי האנדותל להתרבות ולהגירה (פרוליפרציה ומיגרציה), גרוי תאי שריר חלק להתרבות והגירה, יצירה וסגירה (sealing) של מבנים וסקולריים חדשים ויצירה של תווך (matrix) חדש. ניתן להניח שתהליך זה צורך פעולה מאורגנת של מספר מיטוגנים וcascades. חסימה הדרגתית של עורקים כליליים קשורה לעיתים קרובות עם התפתחות זרימה קולטרלית. למרות שנוכחות כלי דם קולרטרליים קשורה בשיפור בתוצאה הקלינית, הרי שבסך הכול ההשפעה אינה מספקת לפצוי על אבדן הזרימה שנגרם עקב החסימה של העורק המקורי.
איסכמיה מיוקרדיאלית הינה גרוי חזק לאנגיוגנזיס. ניתן לבודד מספר גורמי גדילה מתוך שריר הלב האיסכמי, דבר המכוון לכך שמולקולות אלו ממלאות תפקיד חשוב באנגיוגנזיס-הנגרם ע"י איסכמיה. בתוך גורמי גדילה אלו נכללים למשל גורמי הגדילה של פיברובלסטים (החומציים acidic aFGF, FGF1 והבסיסיים – basic bFGF, FGF2), וכן גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם – vascular endothelial growth factors VEGF. אלו הם הידועים ביותר אשר נחקרו רבות ושימשו בהצלחה לגרימת אנגיוגנזיס במודל חיות ניסוי.

שלושה תהליכים שונים יכולים לתרום לצמיחה של גלי דם חדש: וסקולוגנזה, ארטריוגנזה, ואנגיוגנזה.

וסקולוגנזיס
מכוונת ליצירת כלי דם ותא גזע רב-יכולת (pluripotent stem cells) אשר במהלך ההתפתחות העוברית, יוצרים פלקסוס וסקולרי פרימיטיבי. מידת המשמעות והשכיחות של תהליכים אלו ביצירת כלי דם ברקמות בוגרות אינו ברור אף כי יש עדות ראשונית שאולי יש להם תפקיד כזה.

אנגיוגנזיס
המופיע ברקמות בוגרות, אחראי ליצירת כלי דם חדשים החסרים את מעטפת הביניים tunica media מתוך post capillary venules. דוגמא לאנגיוגנזיס נוכל למצוא ביצירת הקפילרות באיזורי ריפוי פצע או לאור הגבול של אוטם שריר הלב.

ארטריוגנזיס
אחראי ליצירת עורקים המכילים שכבת אמצע (tunica media) מפותחת. התהליך כולל סדרת אירועים אשר אינם ידועים עדיין אשר כנראה מערבים "התבגרות" (maturation) של עורקים קולטרליים אשר היו קיימים מבעוד מועד או יצירה מחודשת של כלי דם עם פרוליפרציה ומטורציה של סוגי תאים שונים כולל תאי אנדותל, שריר חלק ופריציטים. דוגמא לארטריוגנזיס הינם עורקים קולטרלים הנוצרים בעקבות חסימה של כלי דם עיקרי.

למרות הקשר ההגיוני בינהם, הרי תהליכי ארטריוגנזיס ואנגיוגנזיס מופיעים בתגובה לסוגי גרויים שונים ולכן ארטירוגנזיס לרוב מתחיל פרוקסימלית, באיזור רחוק מהטריטוריה האיסכמית, כך שאינו תגובה לגרוי היפוקסי איסכמי. גורמים אחרים, כמו לחצי קריעה (shear stress) או שינויים מקומיים פרוטרומבוטיים הוצעו כמעוררי ארטריוגנזיס. מצד שני, אנגיוגנזיס, המופיע בקצוות של רקמות איסכמיות, ככל הנראה מתווך ע"י היפוקסיה רקמתית.
גם אניוגנזיס וגם ארטריוגנזיס זקוקים לסביבה מקומית דלקית. כולל נוכחות מקרופגים המפרישים מתווכי דלקת כמו אינטרלויקין 1 אלפא, TNF אלפא, כמוקינים, HIF (hypoxia induced factor) 1 akpa ופרוטאזות שונות. דיכוי סיסטמי של תפקוד המקרופגים עלול למנוע את יכולת הצמיחה של כלי דם חדשים.
נבדקה היכולת של מספר גורמי גדילה לגרימת אנגיוגנזיס, כולל FGF, VEGF, HGF/SF, IL-8, MCP-1 וכן גורמי גדילה המעורבים בהתפתחות העץ הוסקולרי (כמו אנגיופייטין, או PDGF) או גורמי טרנסקריפציה המעוררים ביטוי של ציטוקינים אנגיוגנים והקולטנים שלהם (למשל HIF 1 alpha).

שתי גישות שימשו להשיג אנגיוגנזיס טיפולי:
העברת גנים, או טיפול בחלבונים.
היתרונות בטיפול בעזרת חלבונים כולל שליטה על מתן הטיפול, הכמות והמינון, ביטחון, יכול להעריך את הפרמקוקינזיס ואת הרמות התרפואיטיות ברקמה ולבסוף המנעות מתופעות לואי ארוכות טווח לא ידועות. החסרונות כוללים בעיקר את זמן מחצית החיים הקצר שלרוב החלבונים בהם עושים שימוש והעלות הגבוהה של יצירת מולוקולות "מלאכותיות", בעיה שמשמעותה גדול לאור העובדה שיש צורך במשך מתן ארוך של רוב הטיפולים. הנסיון המבוסס על מתן חלבונים (גורמי גדילה) בינתיים רב יותר מאשר זה המבוסס על העברת גנים ובאופן פרטני FGF ו-VEGF. חלק מהגורמים המעורבים באנגיוגנזיס אינם ניתנים להעברה כחלבונים ולכן יהיה צורך בשימוש בשיטת העברת הגנים. אלו כוללים למשל HIF-1alpha, PR39.

מספר מחקרים קדם-קליניים בדקו אפשרות העברת גנים עם גורמי גדילה לאנגיוגנזיס. למשל אנדו וירוס הנושא VEGF ביחד עם Human unbilical vein enditheliac cells HUBEC וכן rat aorta smooth muscle infected cells RASMC. התוצאה הייתה פרוליפרציה של תאי ה HUVEC וכן ניאווסקולריזציה בעכברים. במודל אחר נמצא כי הזרקה תוך כלילית של אנדווירוס רקומביננטי המבטאת FGF אנושי גרם להופעת RNA וביטוי חלבוני של הגן. לאחר שבועיים נמצא שינוי בתפקוד איזורי של הלב וזרימת הדם השתפרה. שינויים אלו נשמרו לאורך 12 שבועות. נמצאה עדות לאנגיוגנזיס.

נבדקה היכולת של מתן חד פעמי של אנדווירוס המכיל דנ"א המקודד ל VEGF אנושי לגרום לאנגיוגנזיס ברקמת שומן רטרופריטונאלית. נמצאה עליה במספר כלי הדם תוך 10 ימים, מספרם נשמר משך 30 יום. במחקר אחר הועבר פלסמיד של VEGF שנקשר לבול של אנגיופלסטיה והועבר דרך העור לעורק המפסעה של ארנבת, גרמה להגברת ההתפתחות של עורקים קולטרליים. הופעת עורקים אלו הייתה כרוכה בשינויים המודינמיים עם שיפור בזרימת הדם לגפה האיסכמית.

מחקרים בבני אדם
מחקר בפאזה I של העברת פלסמיד VEGF המועבר בהזרקה ישירה ללב (עם פתיחת בית החזה), בוצעה בחולים עם מחלה כלילית קשה אשר אינם מועברים לשיטות רווסולריזציה רגילות. 5 חולים עברו את הפרוצדורה בשלום, עם שיפור וירידה בתעוקה, ירידה באיסכמיה במפוי לב ובאנגיוגרפיה שיפור בדרוג Rentrop (דרוג למידת הקולטרלים) בכל 5 החולים.
במחקר נוסף נבדקו 20 חולים. נצפה שיפור במיפוי הלב ב-13 מתוך 17 החולים שנבדקו לאחר חודשיים, אך נצפה שיפור אנגיוגרפי עם יצירת לפחות קולטרלים הממלאים עורק אחד בכל החולים.
מחקר נוסף בדק הזרקה תוך שרירית בניתוח ל-21 חולים תוך ניתוח לב (כאשר 15 מתוכם מקבלים גם מעקף ורידי במהלך הניתוח). נצפה בכולם שיפור בתפקוד האיזור בו הוזרק הפלסמיד עם ה VEGF.

למרות שנושא המאמר הוא טיפול במחלות הלב, הרי יש להזכיר את ההצלחה המרשימה של מחקרים בשלב מוקדם לטיפול באיסכמיה של גפים, עם מחקרים שכללו מעל 60 חולים, עם הצלחות אנגיוגרפיות וקליניות מרשימות.

מאידך יש לזכור כי מחקרים אלו כולם נמצאים בשלב מוקדם, ללא קבוצות ביקורת כפולות סמיות או מחקר רב מרכזי. יש לזכור את אותם מקרים מצערים של מטופלים במחקרים אלו שנפטרו לאחרונה בפנסילבניה, בסנט אליזבט בבוסטון ובאוניברסיטת קורנל בניו יורק, דבר שהביא למעשה להפסקה מוחלטת של מחקרים מסוג זה בהוראת משרד הבריאות האמריקני. בבדיקות קפדניות שנעשו נמצא כי החוקרים באותם מוסדות לא שמרו על הכללים הבסיסיים של הסבר לחולים בדבר הסכנות הכרוכות בניסוי והועדות המוסדיות שהיו אמורות לפקח על הניסויים לא הקפידו אף הם על תחומם כתוצאה מעודף עומס עבודה ותירוצים אחרים.

בנוסף יש לזכור מספר נקודות:
1) בחולים סופניים בכלל יש לאינבו (פלצבו) השפעה רבה מאוד.
2) מחקרים אקראיים הינם כלים טובים להגבלת משתנים מטעים, אולם אינם מסוגלים למנוע הטיית החוקרים או את השפעת הפלצבו.
3) רק מחקר כפול סמיות מסוגל למנועה את השפעת הפלצבו ואת הטיות החוקרים.